91网页版

以分离培养厂顿大鼠肾小管上皮细胞为例，操作步骤如下：

1、材料准备

厂顿大鼠（4-6周龄）2-3只、笔叠厂、胶原酶Ⅰ、上皮细胞专用培养基、鼠尾胶原蛋白预包被培养皿、细胞筛（80目、150目）、离心管等。

2、动物处理与肾组织获取

断颈处死大鼠，75%乙醇浸泡5 min后移入超净台。剪开腹腔取出完整肾脏，置于含PBS的玻璃皿中。

3、肾皮质组织分离

剥除肾包膜后，从肾正中纵切，可见皮质与髓质界限明显。用显微剪剪取肾皮质组织。

4、组织剪碎与初步过滤

将肾皮质组织剪成约1 mm3小块，放于80目细胞筛上，使用注射器柱塞轻轻研磨，并用PBS冲洗，收集滤液。

5、进一步筛选肾小管组织

滤液依次通过80目与150目筛网，肾小管结构多聚集于150目筛网表面（如图1）。

6、肾小管收集与消化

反转150目筛，用含2% FBS的PBS冲洗肾小管组织，收集滤液，1200 rpm离心5 min后，加入0.1%胶原酶Ⅰ，在37℃水浴中消化15-30 min。

7、终止消化与细胞重悬

加入笔叠厂稀释终止消化，轻柔吹打至液体混浊，再次离心并用笔叠厂洗涤一次。

8、接种与培养

用预热的上皮细胞专用培养基重悬细胞沉淀，接种于预先用鼠尾胶原蛋白包被的培养皿。培养24-48 h后观察细胞贴壁情况，换液后可见典型“铺路石”样上皮细胞形态